SDR是否可以測量外部代謝產(chǎn)物對葉片O 2消耗率的影響。具體而言，先前在代謝物對葉片O 2消耗速率的影響（使用Astec Global的Q2）中進(jìn)行了觀(guān)察，觀(guān)察到10 mM脯氨酸（Pro）在14小時(shí)內引起大約兩倍的呼吸速率刺激。該測量的關(guān)鍵方面是持續時(shí)間（> 14小時(shí)）及其動(dòng)態(tài)性質(zhì)，因為我們對速率隨時(shí)間的變化感興趣。我采用了SDR設置，因此可以測量包含樣品的試管頂部空間中的氧氣。

背景：需要進(jìn)行植物呼吸測量

     呼吸通量和光合速率是常規適用于植物的代謝通量測量方法，因此兩者都是了解植物生物化學(xué)和理學(xué)的關(guān)鍵工具。當前存在幾種可以測量植物呼吸氣體交換速率的技術(shù)，例如用于CO 2的紅外氣體分析儀和用于氧氣的Clark型O 2電極。兩種技術(shù)都具有低通量和持續時(shí)間短的測量技術(shù)，這阻礙了大規模的實(shí)驗設計，例如，這些實(shí)驗設計將用于植物育種者。澳大利亞研究委員會(huì )植物能量生物學(xué)中心（PEB）一直處于開(kāi)發(fā)和試用用于植物的新呼吸測量技術(shù)的前沿。具體來(lái)說(shuō)，使用O2依賴(lài)于熒光的猝滅已被用于多種高通量技術(shù)，例如SDRSensorDish®Reader，Seahorse或Astec Global的Q2。然而，在植物科學(xué)中很少使用這些技術(shù)，特別是海馬使用漂浮的植物組織的應用受到限制[1]。盡管我們已經(jīng)嘗試過(guò)將標準SDR與先前帶有傳感器斑點(diǎn)的玻璃板結合使用，但是斑點(diǎn)在井底的位置與涉及液體和頂部空間的測量不兼容。目前，PEB的許多呼吸研究均依賴(lài)于第二季度。該機器基本上使用自己版本的傳感器點(diǎn)，這些傳感器點(diǎn)位于頂部螺旋管的蓋子和自動(dòng)傳感器臂中。Q2可以很好地與各種植物組織配合使用，并且可以大大提高測量能力，如Scafaro et al。，2017 [2]中所評估。簡(jiǎn)單的管和蓋設置也適用于液體介質(zhì)的測量。這是一個(gè)很大的優(yōu)勢，因為它允許將化學(xué)物質(zhì)引入呼吸測定法，從而大大擴展了其用途[3]。因此，我想測試SDR是否可以與Q2搭配類(lèi)似的設置（帶有管和傳感器點(diǎn)帽），以及它是否具有*的測量性能。

     圖1：SDRSensorDish®閱讀器設置，用于葉盤(pán)呼吸測量。將葉片切開(kāi)并漂浮在固定在底部架子上的螺帽管內的緩沖介質(zhì)上。旋緊瓶蓋。頂部機架適配器已放置在上面。特別提款權倒掛。

材料與方法

    實(shí)驗設置簡(jiǎn)單，快速（圖1）。當總容量為856 µL的塑料螺帽管充滿(mǎn)600 µL緩沖溶液（50 mM HEPES，10 mM MES，200 µM CaCl 2，pH 6.6）在存在或不存在10 mM Pro（或所需的任何其他化學(xué)物質(zhì)）的情況下，留有256 µL的空氣頂空。將7毫米的葉盤(pán)打孔并漂浮在溶液上，并蓋上管蓋（n = 10）。所有測定中均應包括無(wú)葉盤(pán)的空白試管，因為它們必須去除大量背景噪音并提高數據質(zhì)量。然后使用兩個(gè)3D打印適配器（PreSens）組裝SDR。一個(gè)SDR大約需要15分鐘的設置時(shí)間。提供的蓋子和管子是高質(zhì)量的?？紤]到適配器的小設計，該單元的組裝非常堅固。在室溫下黑暗中收集氧氣數據。該測定以15秒的間隔進(jìn)行過(guò)夜（?17小時(shí)）。數據已導出到Excel進(jìn)行分析。

結果

     圖2顯示了一項實(shí)驗的氧氣測量結果，該實(shí)驗比較了用SDR記錄的未經(jīng)處理的葉片與經(jīng)過(guò)Pro處理的葉片。這些值用于進(jìn)一步的消耗率計算。我通過(guò)減去無(wú)葉盤(pán)的空白試管中的平均消耗率來(lái)校正O 2消耗率隨時(shí)間的變化。然后將速率計算為移動(dòng)1.5小時(shí)窗口（圖3A-B）。O 2消耗率軌跡隨時(shí)間的平滑度是用于計算移動(dòng)斜率的時(shí)間窗口的函數：更大的窗口等于更平滑的軌跡。但是，出于本實(shí)驗的目的，空白消減后殘留的噪聲不是一個(gè)因素。根據Scafaro等人的方法，將O 2百分比轉換為摩爾值。2017 [2]。

     圖2：用SDR記錄的未經(jīng)處理（左）和經(jīng)過(guò)Pro處理（右）葉盤(pán)的氧氣測量值。一個(gè)實(shí)驗的數據。經(jīng)Pro處理的葉盤(pán)的刺激呼吸清晰可見(jiàn)。

    結果表明，SDR板與管和蓋的設置相結合，再現了以前使用Q2獲得的結果。對照葉片中O 2的消耗率隨時(shí)間逐漸下降（圖3A，C）。在Pro處理過(guò)的圓盤(pán)中，如預期的那樣，從開(kāi)始孵育4小時(shí)開(kāi)始，O 2消耗率隨時(shí)間增加（圖3B，C，D）。在圖3D中，我們比較了兩種不同的擬南芥基因型。該測定法能夠通過(guò)重復六次檢測先前觀(guān)察到的品系間表型差異。

資料品質(zhì)

    關(guān)鍵因素是測量之間的技術(shù)差異。與其他呼吸測量設備相比，對照治療的重復痕跡顯示出較低的技術(shù)變異：變異系數為22.7％（其中包括生物學(xué)變異，因此潛在的技術(shù)變異更低）。較低的CV至關(guān)重要，因為它使確定具有合理重復次數的樣品類(lèi)型之間的差異變得更加容易。在Pro處理過(guò)的葉盤(pán)中，由于生物變化，對Pro的響應在葉盤(pán)中不太均勻，因此可以預料到Pro處理過(guò)的葉盤(pán)中O 2消耗率的變化會(huì )增加。
    15 s的測量頻率足以解決數據中隨時(shí)間變化的模式。通過(guò)將設備放置在培養箱中來(lái)控制溫度的能力是植物呼吸研究的另一個(gè)優(yōu)勢。

    圖3：暴露于外源性化學(xué)物質(zhì)時(shí)葉盤(pán)中O 2消耗率的測定。在有或沒(méi)有10mM Pro的條件下孵育擬南芥葉盤(pán)，并在約15小時(shí)的黑暗中測量O 2耗竭率。通過(guò)減去含有緩沖液但沒(méi)有葉盤(pán)的四個(gè)試管的平均速率來(lái)校正速率。（A，B）對照和Pro處理的WT葉盤(pán)的單個(gè)跡線(xiàn)（n = 10）。（C）來(lái)自A和B的平均跡線(xiàn)。（D）來(lái)自Pro和對照處理的WT和突變株的平均跡線(xiàn)，相對于未處理的WT速率顯示（n = 6）。突變株顯示出部分缺乏Pro的呼吸刺激。